DETEKSI DAN IDENTIFIKASI VIRUS TUMBUHAN

DETEKSI DAN IDENTIFIKASI VIRUS TUMBUHAN

Identifikasi virus sebagai penyebab penyakit merupakan faktor kunci yang menentukan keberhasilan pengendalian di lapangan. Identifikasi berdasarkan gejala kasatmata sering tidak cukup untuk menentukan virus penyebab penyakit. Gejala dapat disebabkan oleh infeksi campuran dari beberapa virus, atau virus yang berbeda dapat menimbulkan gejala yang sama.

Pada awal perkembangan diagnosis penyakit virus, gejala penyakit memegang peranan penting untuk menetukan apakah suatu gejala disebabkan oleh satu jenis virus atau lebih. Pengamatan gejala yan diikuti oleh pengamatan mikroskop elektron dilakukan untuk mengetahui bentuk virion yang menginfeksi tanaman. Saat ini, deteksi dan identifikasi virus dapat dilakukan menggunakan teknik biologi molekul yang didasarkan atas runutan nukleotida genom virus yang khas.

Kegiatan belajar ini membahas identifikasi virus tumbuhan berdasarkan sifat hayati, bentuk virion, dan molekul genom virus tumbuhan. Kekhasan runutan nukleotida genom virus tumbuhan telah digunakan untuk mengidentifikasi virus. Saat ini, deteksi dan idenfikasi virus dapat dilakukan menggunakan teknik biologi molekul seperti teknik PCR (polymerase chain reaction) dan teknik pelacak DNA yang dilabel dengan radioaktif atau nirradioaktif.

Setelah mempelajari bab 8 ini, diharapkan mehasiswa mengetahui beberapa cara deteksi dan identifikasi berdasarkan sifat molekul virus dengan teknik PCR dan teknik pelacak DNA yang dilabel dengan nirradioaktif. Selain itu, diharapkan pula mahasiswa mngerti cara diagnosis penyakit virus tumbuhan berdasarkan sifat hayati virus, elektron mikrograf, dan teknik biologi molekul.

A.                Identifikasi Virus Berdasarkan Sifat Hayati dan Bentuk Virion

Sifat virus yang menjadi dasar identifikasi virus adalah gejala penyakit, kisaran tanaman inang, dan kekhasan vektor. Selain itu, mikroskop elektron juga dapat digunakan untuk mengetahui genus dan famili virus berdasarkan bentuk dan ukuran virion. Beberapa hal yang perlu diketahui agar identifikasi virus dapat dengan mudah dilakukan, adalah sebagai berikut.(1) Setiap virus mempunyai kisaran inang dapat dijadikan sebagai salah satu cara identifikasi virus. (2) Beberapa virus mungkin dapat menginfeksi satu jenis tanaman inang, tetapi salah satu virus menginfeksi secara sistemik dan yang lain hanya infeksi lokal. (3) Setiap virus mempunyai vektor yang berbeda, sehingga salah satu cara untuk mengetahui virus tertentu.

1.                  Identifikasi Berdasarkan Gejala dan Kisaran Tanaman Inang

Gejal penyakit virus dilapangan merupakan data pertama yang diperlukan untuk identifikasi virus. Demikian juga dilaboratorium, gejala penyakit yang ditimbulkan pada suatu seri tanaman indikator merupakan informasi yang diperlukan untuk identifikasi virus tumbuhan. Gejala penyakit merupakan aspek yang sangat penting untuk menentukan tindakan pengendalian penyakit terutama untuk para petani dan petugas pertanian.

Kisaran tanaman inang virus yang belum diketahui dan gejala infeksi jugamerupakan data yang penting ntuk identifikasi. Identifikasi berdasarkan gejala penyakit sering membingungkan karena gejala penyakit yang timbul dipengaruhi oleh strain virus dan jenis varietas tanaman. Oleh sebab itu, untuk memudahkan identifikasi virus, diperlukan pengetahuan tentang keragaman gejala penyakit yang ditimbulkan oleh berbagai strain virus pada beberapa varietas tanaman inang. Selain faktor strain virus dan varietas tanaman inang , faktor lingkungan juga mempengaruhi ekspresi gejala infeksi virus tumbuhan. Tipe gejala infeksi virus pada tanaman inang yang khas (tanaman inang diferensial) dapat menjadi petunjuk awal untuk identifikasi virus.

Gejala infeksi dan kisaran tanaman inang telah digunakan untuk identifikasi virus tumbuhan. Sebagai contoh,untuk membedakan penyebab penyakit yang menimbulkan gejala bilur (blotch) pada kacang tanah disebabkan oleh PStV atau PMoV dapat dilakukan dengan menginokulasikan ekstrak tanaman sakit secara mekanik pada tanaman C. amaranticolor dan phaseolus vulgaris varietas Topcrop. PStV akan menimbulkan gejala bercak lokal pada C. amaranticolor dan tidak menginfeksi P. Vulgaris;sebaliknya, PMoV akan menimbulkan gejala bercak lokal pada P. Vulgaris dan tidak menginfeksi C. Amaranticolor (Tabel 12)

Tabel 12. Gejala Infeksi Beberapa Virus yang Menyerang Kacang Tanah pada Tanaman Indikator

Virus	Gejala pada kacang tanah	Gejala infeksi PStV				Pustaka
		Ca	Cq	Pv	Nb
PStV	blotch-stripe	LL	LL	-	MR	Demski et al.,1984
PeMoV	blotch-mild mottle	-	-	LL	TT	Demski et al.,1984; Fukumoto et al., 1986
CMMV	vein clearing-mild mottle	LL	-	TT	TT	Iwaki et al., 1986
TSWV	chlorotic fan-spot	LL	LL	TT	SyNKS	Jenser et al., 1996

Keterangan:

Ca        : C. amaranticolor                               -                       : tidak terjadi infeksi

Cq       : C. guinoa                                                      MR      : mosaik ringan

Pv        : P. vulgaris cv. Topcrop                      TT                    : data tidak tersedia

Nb       : N. benthamiana                                             SyNKS : bercak nekrosis dan klorosis sistemik

LL       : bercak loka

2.                  Indentifikasi Virus Berdasarkan Kekhasan Vektor

Virus yang menyerang tanaman dapat diidentifikasi berdasarkan hubungan khas virus dan vektornya. Sebagai contoh, virus yang secara alamai menyerang kedelai terdiri atas soybean stunt virus(SSV), indonesian soybean dwart virus (I-SDV), bean yellow mosaic virus (SMV), peanut stripe virus(PStV), cowpea mild mottle virus (CPMMV); dan hanya CPMMV yang dapat ditularkan oleh Bemisia tabacci. Berdasarkan hubungan khas itu, apabila tanaman kedelai menunjukan gejala penyakit virus dari lapangan, dapat dikatakan bahwa patogennya adalah CPMMV. Apabila di laboratorium, penyakit itu dapat ditularkan oleh B. tabicci.

3.                  Identifikasi dengan Mikroskop Elektron

Mikroskop electron, yang mempunyai perbesaran > 50.000 kali, dapat digunakan mengamati virion. Identifikasi menggunakan mikroskop electron dapat dilakukan dengan mengamati bentuk dan ukuran virion. Berdasarkan bentuk dan ukuran itu, dapat ditentukan jenis virus yang menyerang tanaman. Contoh pengamatan virus menggunakan mikroskop electron dapat dilihat pada gambar 52.

B.                 Identifikasi Berdasarksn Sifat Molekul Virus

Deteksi virus berdasarkan runutan nukleotida genom virus merupakan metode yang sangat khas karena runutan nukleotida genom virus berbeda untuk setiap jenis virus. Hasil pengamatan menunjukan bahwa virus yang berada pada kelompok taksonomi yang berbeda hanya mempunyai kesaman runutan nukleotida 39%-53%. Sebaliknya , virus dalam spesies yang sama tetapi strain berbeda , mempunyai kesamaan 83%-99% (Frankel et al., 1989). Oleh sebab itu, penggunaan sifat kekhasan runutan nukleotida virus untuk deteksi dan dentifikasi virus mempunyai ketepatan yang tinggi terhadap virus sasaran.

Deteksi berdasarkan kekhasan runutan nukleotida ini dapat dilakukan dengan teknik RT-PCR dan DNA pelacak (probe). Kedua metode itu mempunyai daya deteksi yang tinggi terhadap virus. Metode deteksi yang demikian banyak digunakan dalam virology tumbuhan seperti (1) kajian epidemiologi  penyakit lapangan, (2) pemantauan insiden penyakit dilapangan , (3) pemeriksaan virus untuk sertifikasi benih bebas virus , (4) deteksi virus dalam vector yang digunakan dalam peramalan penyakit dan system peringatan dini keterjadian penyakit dilapang (early warning system), (5) infeksi virus baik dalam tanaman transgen, dan (6) karantina tumbuhan untuk menegah penyebaran pathogen dari satu daerah ke daerah lain.

1. Deteksi Virus Menggunakan Teknik PCR

PCR merupakan teknik biologi molekul yang pertama kali dikenalkan pada tahun 1985. Banyak perbaikan teknik PCR lebih banyak digunakan untuk diagnosis penyakit pada manusia dan hewan. Tetapi saat ini, untuk mendeteksi pathogen pada tanaman atau bahan tanaman yang akan dijadikan benih dan bibit , juga banyak digunakan teknik PCR.

PCR merupakan teknik relative sederhana dan merupakan teknik penggandaan (amplifikasi) dengan menggunakan DNA primer yang memiliki runutan nukleotida khas untuk molekul asam nukleat yang akan deteksi. Primer merupakan molekul oligonukleosida (ssDNA) yang disintesis in vitro dan runutan nukleotidanya disesuaikan dengan genom virus yang akan dideteksi . PCR hanya akan menggandakan asam nukleat yang sesuai dengan primer . hasil penggandaan PCR diamati menggunakan elektroforesis agarose dan sinar ultraviolet.

Deteksi untuk virus yang memiliki genom RNA, seperti sebagian besar virus tumbuhan, diperlukan modifikasi teknik PCR karena molekul sasarannya adalah RNA. RT-PCR merupakan modifikasi dari teknik PCR yang dapat menggandakan RNA menjadi  DNA. Indikasi adanya virus dengan teknik ini diamati dengan elektroforesis gel agarosa. Reaksi positif ditunjukan dengan adanya penggandaan DNA yang ditargetkan dank has terhadap virus yang ingin diketahui.

Hal yang memengaruhi keberhasilan deteksi virus dengan teknik PCR adalah pemilihan primer oligonukleotida dan optimasi prosedur PCR. Pemilihan runutan nukleotida target harus mengacu pada runutan nukleotida virus yang telah diketahui atau sudah dipublikasikan . untuk target diagnosis runutan nukleotida target harus berkisar antara 100-600 bp,dan mempunyai kandungan GC 50%, serta terjadi struktur yang menggumpal (hairpin)

RT-PCR terdiri atas dua reaksi, yaitu reaksi transkripsi balik (reserve transcription) yang menggunakan genom RNA virus sebagai cetakan dan menghasilkan cDNA primer (untai tunggal) serta reaksi penggandaan (PCR). Untuk mendapatkan cDNA untai ganda, cDNA primer digunakan sebagai cetakan. RT-PCR akan menggandakan runutan nukleotida pada genom RNA virus . primer yang digunakan harus dapat menggandakan bagian khas untuk virus yang akan dideteksi. Sebagai contoh, Akin (2000), telah mengembangkan metode deteksi molekul PStV, virus penting yang menyerang kacang tanah, dengan metode RT-PCR pasangan primer PSR1 dan PST2, yang akan mengamplifikasi 234 bp yang merupakan cDNA dari sebagian 3’ UTR dan gen CP; sedangkan pasangan PST1 dan PST4 menghasilkan cDNA 1,2 Kb (Gambar 53).

Deteksi virus dengan teknik RT-PCR dilakukan dalam satu tabung reaksi RT-PCR. Reaksi RT-PCR dilakukan dengan program reaksi: 50⁰ C-30 menit, diikuti 53 siklus yang terdiri atas denaturasi awal (initial denaturation) pada suhu 94⁰ C selama 45 detik, penempelan primer (annealing) 55⁰ C selama 45 detik, dan perpanjangan primer (extension) 72⁰ C selama 90 detik, diikuti satu siklus untuk perpanjangan akhir primer (final extension) pada suhu 72⁰ C selama 10 menit. Hasil RT-PCR dianalisis menggunakan elektroforesis gel agarosa. Ontoh hasil deteksi PStV dengan RT-PCR pada daun kacang tanah dapat dilihat pada Gambar 54.

2.Deteksi Virus tumbuhan dengan pelacak DNA

            Pelacak DNA adalah sepotong ologonukleotida yang mempunyai runutan basa yang berkomplemen dengan runutan nukleotida virus yang akan dideteksi. Untaian tunggal pelacak DNA itu akan berpasanga dengan asam nukleat virus yang basanya berkomplemen dengan pelacak. Perpasangan dua untai DNA membentuk untai ganda dsDNA terjadi secara anti paralel dan masing masing untai diikat oleh ikatan hydrogen pada basa purin dan pirimidin (G = C dan A = T) (Gambar 55). Untai DNA yang terpisah cenderung berpasanga lagi sesuai untai pasangan. Sifat kekhasan perpasanga itu dimanfaatkan untuk membuat potongan pelacak untuk deteksi khas virus.

Gamba 55, pelacak DNA (5’ACTG3’) yang runutan nukleotida khas untuk dsDNA yang menjadi sasaran deteksi.

Apabila runtunan khas suatu virus sudah  diketahui maka dapat disentis secara in vitromenggunakan teknik PCR untai komplemennya dan kemudian digunakan untuk melacak ada atau tidaknya runtunan nukleutida komplemennya dalam sampel yang akan diperiksa. Untuk memudahkan pengamatan ada tidaknya hibridasi antara DNA target DNA pelacak dapat dilakuakn dengan melabel DNA pelacak menggunakan unsur raadioaktif seperti 35S atau menggunakan label nirradioaktif seperti biotin atau digoksigenin. Deteksi menggunakan pelacak berlabel radioaktif dikenal dengan teknik southern blot; sedangkan dengan pelacak berlabel nitradioaktif dikenal dengan hibridasi dot-blod Gambar 56,

(A) daun kacang tanah yang terinfeksi PStV,

(B) hasil deteksi PStV pada daun kacang tanah dengan teknik   hibridasi dot blotpelacak digoxigenin-DNA (Akin, 2002).lajur: kontorl posirif; control negatif (daun kacang tanah sehat); kontol positif terinfeksi (daun kacang tanah terinfeksi PStV).

Gambar 57, Deteksi PStV pada benih (seed)yang didapatkian dari tanaman induk yang terinfeksi PStV dari lapangan (Akin 2002),

(A) Kacang tanah sehat (kiri) dan sakit (kanan) dari lapangan

(B)  Biji kacang tanah dari tanaman induk yang terinfeksi PStV

(C)  Hasil deteksi pada pengenceran sampel 1/20, 1/100, dan 1/500, lajur kantrol positif dan negatif, dan biji yang terinfeksi PStV

C. Rangkuman

            Pada awal perkembangan diagnolisis penyakit virus, gejala penyakit memegang peranan penting untuk menentukan apakah suatu gejala disebabkan oleh yaitu satu, dua, atau lebih jenis virus gejala yang diikutioleh pengamatan mikroskop electron dilakukan untuk mengetahui bentuk viron yang menginfeksi tanaman. Saat ini, deteksi dan indeteksi virus dapat dilakukan menggunakan dengan teknik biologi molekul yang didasarkan atas runtunan nukleotida genom virus yang khas.

            Sifat virus yang menjadikan dasar  identivikasai virus adalah gejala penykit, kisaran tanaman inang, dan kekhasan vector. Selain itu, mikroskop electron juga dapat digunakan untuk mengetahui genus dan family Virus berdasarkan bentuk dan ukuran Virion. Beberapa hal yang perlu diketahui agar identifikasi virus dapat dengan mudah dilakukan adalah sebagai berikut : (1) setiap virus mempunyai kisaran inang yang berbeda, sehingga hubungan khas antara virus dan tanaman inang dapat dijadikan sebagai salah satu cara identifikasi virus, (2) beberapa virus mungkin dapat menginfeksi satu jenis tanaman inang, tetapi salah satu virus mrnginfeksi secara sistemik dan yang lain hsnys infeksi local. (3) setiap virus mempunyai Vektor yang berbada, sehingga hubungan ini dapat dijadikan sebagai saslah satu cara untuk mengetahui virus tertentu.

Deteksi virus bardasarkan runutan nukleotida genom virus merupakan metode yang sangat khas karena runutan nukleotida genom virus berbeda  untuk setiap genom virus deteksi berdasarkan runutan nukleotida ini dapat dilakukan dengan tehnik PCR dan pelacak DNA kedua metode ini mempunyai daya deteksi yang tinggi terhadap virus. PCR merupakan teknik yang relative sederhana dan merupakan teknik penggandaan (amplifikasi) menggunakan DNA primer yang runtunsn nukleotidanya khas untuk molekul asam nukleat yang akan dideteksi. Primer meripakan molekul oligonukleotida (ssDNA ) yang disintensis secara in vittro yang runutan nukleotidanya disesuaikan dengan genom virus yang dideteksi. Pelacak DNA adalah sepotong ologonukleotida yang mempunyai runutan basa yang komplemen dengan runutan nukleotida virus yang akan dideteksi. Untaian tunggal pelacak DNA itu akan brpasangan dengan asam nukleotida virus yang basanya komplemen dangan pelacak.

Daftar Pustaka

Akin,M.H.2000.”aplikasi teknik RT-PCR untuk deteksi PStV ( peanut stripe virus ).” Dalam agrotropika,V (2) : 20-25

Akin, M.H. 2000.” Pengkelonan dan perunutan nukleotida Gen protein selubung dan 3 URT  ( untranslated region ) peanut stripe virus. “ dalam : jurnal ham dan penyakit tumbuhan tropika . 1 (1) : 1-6

Akin,M.H 2000,” Aplikasi hibridisasi molekul dengan pelacak  digoxiginin DNA untuk deteksi PStV ( peanut stripe virus ).” Dalam : jurnal penyakit tumbuhan tropika, Vol. 1, No. 2: 75-79

Akin,M.H and Sudarsono. 1997. “  Detection of PStV isolates originated from 12 provinces in indonesia and characterization of the isolates based on their symptoms in varius peanut cultivars,” in: the indonesian biothechnology conference . jakarta, june, 17-19,1997

Collmer, C.W.,M .F.  Marston,S.M. Albert, S.Bajai, H.AA. Maville, S.E. Ruuska,E..J.Vesely,and M.M. Kyle.1996.” The nucleotide sequence of the coat protein gen and 3  untraslated regio of azuki bean mozaic potyvirus, a member of the bean common mosaic virus subgrup.” In: MPMI,9 (8) :758-761

Demski, J.W. D.V.R. Rendy, jr.G. sowell and D.Bays. 1984.” Peanut stripe virus-a new seed-borne potyvirus from China infecting groundnut (arachis hypogaea ).” In: Ann. App. Biol. 105 :495-761

Dietzgen, R.G.Z., Xu and P. Teycheney.1994. “ Digoxigenin-labeled  RNA probes for the detection of two potyviruses inficting peanut ( Arachis hypogaea ).´in Plant Diseae, 78 (7): 708-711

Fankel, M.J,. C.W. Ward, and D.D Shukla. 1989, “ the use of 3 non –coding nucleotide sequence in taxnomy of potyviruses: Application to watermelonmosaic virus 2 and soybe mosaic virus-N.” In: J.Gen.Virol. 70: 2775-2783

Fukumoto, F.P. Thongmeearkom, M. Iwaki, D. Choopanya, N. Sarindu, N. Deema, and T Tsuchizaki. 1986. “peanut mottle virus occuring on peanut in Thailand . “ in: Kajiwara  J. and S.Konno ( eds ). Technical Bulletin of The Agriculture Research Center Japan

Iwaki, M.P. Thongmeearkom, Y. Honda, M.Prommin, N. Deema, T.Hibi, N. Lizuka, C.A. Ong, and N.Saleh. 1986. “ Cowpae mild mottle virus occuring on soybean an peanut in Southeast Asian C ountries .” in: Kajiwara , J. And S. Konno ( eds ). Technical bulletin of the agriculture research center. Japan.

Jenser, G.R. Gaborjanyi, R. Vasdunnyei, and A. Almasi 1996.”tamoto spotted wilt virus in hungary . “ in: George Kuo, C. ( ed) Acta Horticulture, 431. AVRDC. Taiwan

Matthews, R.E.F.1991. plant virology.3 ED. Academic Press. New York.

Saleh,N. And Y.Baliadi. 1992. “ penyakit virus kacang tanah  ( peanut stripe virus ) dan usaha pengendaliannya. “ dalam: monograf balittan malang. Nomor 8 : 22hlm

            E. Pelatihan

1. Jelaskan beberapa sifat hayati virus tumbuhan yang perlu diketahui agar indentifikasi mudah dilakukan?

2. mengapa identifikasi yang hanya dilakukan berdasarkan gejala penyakit sering tidak tepat

3. jelaskan mengapa sifat kekhasan hubungan virus dan vektor dapat dijadikan sebagai dasar identifikasi virus

4. jelaskan mengapa metode deteksi yang tepat dan peka sangat diperlukan dalam virologi tumbuhan.