PEMURNIAN DAN SEROLOGI VIRUS TUMBUHAN

PEMURNIAN DAN SEROLOGI VIRUS TUMBUHAN

Bab ini terdiri atas tiga pokok bahasan, yaitu permurnian virus, serologi dan tenik serologi virus tumbuhan. Pemurnian virus membahas tentang berbagai aspek pemurnian virus untuk mendapatkan virion yang terpisah dari bagian tanaman dan yang dapat digunakan sebagai antigen dalam produk antiserum virus tumbuhan. Bahasan pemurnian virus ini meliputi pemilihan tanaman inang perbanyakan virus seelum pemurnian virus, pemilian dapar untuk mendapatkan sap tanaman yang mengandung virus dan metode pemisahan virus dengan bagian tanaman inang. Aspek serologi akan membahas dasar dan teknik uji serologi. Dasar-dasar serologi membahas tentang reaksi imunitas, produksi antiserum khas virus dan reaksi antibodi dan antigen. Sementara, aspek teknik serologi membahas berbagai teknik uji serologi yang banyak digunakan dalam virologi tumbuhan.

Setelah mempelajari materi dalam Bab 7 ini, mahasiswa diharapkan memahami landasan teori tentang pemurnian virus tumbuhan, serologi virus tumbuhan dan berbagai teknik serologi yang digunakan untuk identifikasi dan deteksi virus tumbuhan.

A.                PEMURNIAN VIRUS TUMBUHAN

Pemisihan virion dengan bagian tanaman inang secara in vitro dikenal dengan istilah pemurnian viru. Virus murni diperlukan sebagai antigen dalam produksi antiserum. Oleh sebab itu, produser pemurnian virus harus menghasilkan virus murni berupa virion yang utuh dan tidak dicampuri oleh sisa tanaman inang.

            Kemurnian virion merupakan faktor penting yag harus diperhatikan untuk memproduksi antibodi virus. Virus yang tidak murni apabila dijadikan antigen akan menghasilkan antibodi selain bereaksi dengan virus juga bereaksi dengan bagian tanaman yang tersisa. Sisa tanaman itu juga dapat mengimbas terentunya antibodi yang bereaksi tidak khas terhadap virus yang menjadi sasaran deteksi.

            Perlakuan fisik dan kimia banyak digunakan untuk memisahkan virion dengan bagian tanaman inang. Prosedur pemurnian virus berbeeda untuk setiap jenis virus tumbuhan tergantung dari sifat da kimia protein terselubung dan genom virus. Empat prinsip dasar yang harus tanaman diperhatikan dalam memurnikan virus tumbuhan, yaitu (1) pemilihan tanaman inang yang digunakan dalam perbanyakan virus agar diperoleh konsentrasi virus yang tinggi dan senyawa penghambat yang rendah; (2) komposisi larutan yang digunakan untuk mengektsrak jaringan tanaman inang yang tepat agar virus tidak kehilangan keinfektifannya; (3) perlakuan klarifikasi yang dapat menghilangkan bagian tanaman dan meninggalkan virus; serta (4) pemisahan dan pemadatan virus dalam suspensi agar mudah memperoleh virus yang murni. Secara umum, prosedur pemurnian virus tumbuhan yang akan digunakan sebagai antigen dapat dilihat pada gambar 39.

1.                   Tanaman Perbanyakan Virus Tumbuhan

Pemilihan tanaman inang sebagai tanaman perbanyakan virus perlu diperhatikan agar diperoleh konsentrai virus yang tinggi kondisi lingkungan tumbuh tanaman inang juga mempengaruhi konsentrasi virus dalam tanaman. Kondisi lingkungan yang mempengaruhi konsentrasi adalah suhu, unsur hara, umur tanaman saat diinokulasi dan dipanen.

            Tanaman perbanyakan virus lebih baik apabila kandungan tanin, asam organik dan senyawa fenol rendah karena senyawa tersebut merusak dan menginaktifkan virion dalam pemurnian. Tanaman yang anyak digunakan sebagai tanaman perbanyakan virus karena kandungan tanin dan asam organik yang relatif rendah adalah tanaman dalam famili Solanaceae, Leguminoseae, Chenopodiaceae, Cucurbitaceae dan Graminaea.

a.                   Kondisi Lingkungan

Suhu lingkungan pada tanaman inang mempengaruhi laju replikasi virus. Sebagai contoh, tanaman barley yang diinokulasi BSMV (barley stripe mosaic virus) hanya memerlukan waktu satu minggu  untuk menimbulkan gejala sistematik bila ditumbuhkan pada suhu 20˚c. Sementara, pada suhu 15˚c memerlukan waktu empat minggu. Perbedaan masa inkubasi penyakit itu menunjukan besarnya pengaruh suhu terhadap laju replikasi virus dalam tanaman inang. Selain itu, pengaruh cahaya dan unsur hara tanaman juga mempengaruhi laju replikasi virus dalam tanaman inang. Secara umum, makin baik pertumbuhan tanaman, makin cepat replikasi virus.

b.                   Pemilihan Jaringan Tanaman

Konsentrasi virus dalam bagian tanaman beragam dan tergantung pada jenis jaringan, umur tanaman dan tahap perkembangan penyakit. Daun merupakan organ tanaman yang banyak digunakan sebagai sumber virus untuk memperoleh virus murni tetapi pada virus tertentu, jaringan lain lebih baik. Daun yang menunjukan gejala sistematik biasanya mempunyai kandungan virus yang lebih besar bila dibandingkan dengan daun yang bergejala bercak lokal. Kandungan virus tertinggi biasanya tercapai saat awal tanaman menunjukan gejala penyakit. Replikasi virus lebih cepat terjadi pada saatdaun tumbuh dibandinkan pada daun sudah tumbuh sempurna.

2.                  Penghomogenan Jaringan Tanaman

Penghomogenan adalah penghancuran organ tanaman yang dijadikan sebagai sumber virus. Virion yang terdapat dalam sitoplasma akan lepas dari sel tanaman inang. Oleh sebab itu, penghomogenan harus dilakukan agar senyawa organik yang terdapat dalam sel tidak merusak virion. Banyak senyawa organik yang dapat merusak virion.

             Senyawa fenol dapat bereaksi dengan protein selubung virus membentuk ikatan hidrogen. Senyawa fenol juga dapat teroksidasi membentuk senyawa quinon yang lebih reeaktif dalam membentuk ikatan kovalen dengan gugus SH pada asam amino yang menyusun protein selubung virus. Oksidasi fenol menjadi quinon dapat terjadi dengan bantuan polifenoloksidase, peroksidase atau tanpa bantuan enzim.

            Jenis dan konsentrasi dapar ekstrasi harus dipilh agar virus dapat stabil dan tidak teragregasi. Dapar ekstrasi yang banyak digunakan mempunyai pH 6-8, konsentrasi 0,1 M atau lebi rendah serta mengandung enyawa antioksidasi (reducing agents) dan senyawa pengkelat (chelatting agents). Polyvinipyrrolidone, gelatin dan alkaloid juga dapat ditambahkan Untuk mengikat dan menghilangkan senyawa tanin. Buffer ekstraksi yang mempunyai pH tinggi secara umum dapat membantu melepaskan virus yang terikat pada dinding sel tanaman.

            Kerusakan virion akibat senyawa fenol dapat di atasi dengan menghambat terbentuknya kompleks antara polifenol dan virus atau menghambat enzim pengoksidasi fenol (polifenoloksidase). Kompleks antara senyawa fenol dan virus dapat di hambat oleh peningkatan pH suspensi sertapenambahan nikotin sitrat, albumin, dan kasein. Polifenoloksidase merupakan enzim dengan aktivator Cu⁺⁺, yang dapat di hambat dengan senyawa pengkelat Cu⁺⁺ dan antioksidan. Senyawa pengkelat yang dapat di gunakan antara lain adalah Na-DIECA (sodium dietilditiokarbamat) atau Na-EDTA (sodium etilenediamintetra-asetat). Senyawa antioksidasi yang dapat di gunakan adalah asam askorbat, sistein, sodium sulfit,asam tioglikolat, dan merkaptoetanol.

            Ion Ca⁺⁺ dan Mg⁺⁺ sangat penting untuk memprtahankan keutuhan virion. Ion tersebut juga terbuktimempunyai peranan dalam infeksi virus. Penambahan ion tersebut dapat mengurangi pengaruh negatif dari penambahan senyawa pengkelat (Na-EDTA dan Na-DIECA). Beberapa ion hidrogen dalam dapar ekstraksi dapat mengikat ion Ca⁺⁺ dan Mg^++. Beberapa dapar yang tidak mengikat ion Ca⁺⁺ dan Mg⁺⁺ adalah dapar fosfat, borat, citrat, dan Tris [tris (hydroxymetil)].

            Konsetrasi ion hidrogen dalam media penghomogenan sangat penting untuk kestabilan virion. Virion lebih stabil pada konsentrasi ion hidrogen pada titik isoelektris. Pada umumnya, virus tumbuhan mempunyai titik isoelektris dibawah pH netral. Pada kondisi alkali, konsentrasi ion hidrogen menjadi rendah sehingga ikatan antara protein selubung dan asam nukleat virus akan melemah. Oleh sebab itu, pH tinggi banyak digunakan untuk memisahkan antara asam nukleat dengan protein selubung virus. Sebagai contoh, CCMV (cowpea chlorotic mottle virus) mempunyai titik isoelektris 3,65 pada pH 5; pada pH 7 virion akan membengkak sehingga asam nukleat virus menjadi peka terhadap ribonuklease.

Tabel 11. Jenis Dapar Yang Banyak Digunakan Untuk Perlakuan Penghomogenan Dalam Pemurnian Virus Tumbuhan.

Dapar	Konsentrasi	Keasaman (pH)
Potasium fosfat	0,01-0,5 M	7,0-8,0
Sodium borat	0,05-0,5 M	7,6-8,5
Sodium asetat	0,1-0,5 M	4,5-6,2
Sodium sitrat	0,1-0,5 M	6,0-7,4
Tris-HCl	0,1 M	7,2-8,4

Kestabilan virion juga dipengaruhi oleh kekuatan ion larutan (ionic strength). Beberapa virus tumbuhan lebih stabil pada dapar yang mempunyai konsentrasi lebih tinggi. Sebagai contoh, BSMV (barley stripe mosaic virus) lebih stabil di dalam dapar Tris pH 7 dengan konsentrasi 0,1-0,2M dari pada dalam dapar Tris dengan pH yang sama tapi mempunyai konsentrasi larutan yang lebih rendah.

Ekstraksi daun dapat dilakukan dengan menggunakan mortar atau blender untuk jumlah yang lebih banyak. Virus masih dapat bertahan selama beberapa menit jika suhu dapat dijaga selalu di bawah 30^o C. Untuk virus yang tidak stabil, suhu dapar yang digunakan harus rendah. Virus yang berada dalam jaringan pembuluh ayak, seperti Luteovirus, membutuhkan nitrogen cair atau perlakuan enzim untuk melepaskan virus dari jaringan pembuluh ayak dan menjaga agar virus tidak rusak.

3. Denaturasi dan Klarifikasi

            Tahap awal dalam pemurnian virus tumbuhan dari ekstrak tanaman inang adalah menghilangkan makro molekul yang berasal dari tanaman inang. Ekstrak daun mengandung protein, ribosom, polisom, fragmen selaput sel,organel, dan dinding sel. Kandungan makro molekul itu beragam tergantung pada umur fisiologi daun. Ekstrak daun muda lebih banyak mengandung ribosom dan berbagai jenis protein di bandingkan dengan daun yang lebih tua. Kestabilan dan keaktifan anzim dari protein juga beragam tergantung pada umur daun.

            Kebanyakan protein tidak dapat di endapkan bersama virus pada sentrifus kecepatan tinggi dan masih terdapat fraksi cair hasil sentrifus. Beberapa bagian yang dapat mengendap bersama virus adalah fragmen selaput, kloroplas, mitokondria, organel lainnya ( ribosom, polisom, rubisco [ribulose bis-phosphate carboxylase]), dan fitoferitin. Kebanyakan prosedur pemurnian virus bertujuan untuk mendenaturasi, melarutkan dan mengendapkan bahan tersebut tanpa merusak virus yang diinginkan.

            Pembekuan jaringan tanaman sebelum ekstraksi dapat merusak bagian tanaman tanpa merusak virus. Triton X-100 (nonionic detergent) dapat digunakan untuk melarutkan kloroplas dan selaput sel tanaman inang. Triton X-100 memengaruhi virus yang mempunyai mantel lipoprotein.

            Ekstrak daun dengan volume yang sama dengan kloroform banyak digunakan untuk membuang bagian tanaman yang berwarna. Beberapa pelarut organik seperti kloroform, butanol, dan aseton dapat digunakan untuk mendenaturasi protein yang tetdapat dalam kloroplas, mitokondria, dan retikulum endoplasma. Eter banyak digunakan untuk pemurnian virus yang berbentuk tongkat.

4. Pemisahan dan Pengendapan Virus

a. Presipitasi Polietilen Glikol (PEG)

            protein selubung virus dapat bermutan positif atau negatif tergantung pada kondisi ion larutan. Penambahan reagen yang dapat menetralkan muatan atau mendehidrasi virion dapat mengakibatkan terjadinya presipitasi virus. Virion yang telah mengalami presipitasi akan mudah diendapkan dengan sentrifus kecepatan rendah.

            Polietilen glikol (PEG) merupakan polimer dari rantai panjang etilen oksida dengan rumus molekul.

HO-CH₂(CH₂-OCH₂)_nCHOH

            PEG larut dalam air, bersifat anhidrous dan mampu menyerap air. PEG dapat mengendapkan virus dengan cara dehidrasi virion.

b. Ultrasentrifus dan Sentrifus Gradien

            Ultrasentrifus merupakan metode pemisahan dan pengendapan virus. Pelapisan dasar tabung sentrifus dengan larutan sukrosa 20% membantu memisahkan virus dari bagian tanaman lainnya. Selain itu, pelapisan tersebut dapat mengurangi agregasi antar virion. Sentrifus yang terlalu lama dapat menimbulkan kontaminasi dari makro molekul yang mempunyai laju sedimentasi lebih rendah dari virus.

            Sentrifus Gradien merupakan metode yang efisien digunakan untuk memisahakan virion dengan makro molekul tnaman inang. Sentrifus gradien adalah pemisahan berdasarkan koefisien sedimentasi dari makro molekul yang ada dalam suspensi virus. Gradien sukrosa 20% - 50% banyak digunakan untuk memisahkan virus dengan makro molekul yang lain.

B. Serologi Virus Tumbuhan

            Reaksi khas antara antibodi dan antigen terjadi pada reaksi pertahanan hewan apabila kemasukan antigen (patogen atau benda asing). Reaksi khas itu dapat juga terjadi secara in vitro apabila amtibodi yang diproduksi hewan itu di isolasi dan di reaksikan dengan anti gen yang mengimbasnya. Sifst khas reaksi antibodi dan antigen dimanfaatkan sebagai alat identifikasi patogen dan diagnosis penyakit virus pada tanaman. Secara umum, reaksi serologi dapat digambarkan sebagai berikut.

Antibodi + Antigen               Presipitasi

Pada mulanya, uji serologi ini dimanfaatkan dalam identfikasi patogen yang menyerang manusia dan hewan. Namun, sejak Beale pada tahun 1928 berhasil mengimbas pembentukan antibodi khas untuk TMV, uji serologi sudah menjadi standar identifikasi virus pada laboratorium virologi.

Dasar-dasar imunologi dapat dipahami sebagai berikut. Apabila hewan percobaan di injeksi antigen (benda asing), sel APC (antigen- Preenting cells) sel T sel B akan bereaksi mengimbas terbentuknya antibodi yang khas terhadap antigen. Antibodi yang terbentuk akan bereaksi dengan antigen dan membentuk kompleks antibodi-antigen dalam bentuk endapan.reaksi itu dinamakan dengan reaksi pertahanan.

Reaksi pertahanan dalam hewan dapat berupa imunitas humoral atau imunitas sel. Imunetas humoral atau imunitas sel. Imunitas humoral adalah reaksi ketahanan yang terjadi melalui pembentukan antibodi yang kompatibel dengan antigen. Sebaliknya, imunitas sel merupakan reaksi ketahanan yang terjadi melalui penghancuran benda asing secara langsung dengan enzim. Pada kasus tertentu, benda asing rusak selama tanggap imunitas sel sehingga tidak terbentuk antibodi dan benda asing tersebut tidak antigenik.

1.      Antigen

Antigen adalah setiap senyawa yang mampu mengimbas tanggap imun bila diinjeksikan ke dalam hewan berdarah panas. Senyawa yang dapat merangsang terbentuknya antibodi biasanya merupakan benda asing yang secara genetika tidak dapat disandikan oleh hewan percobaan. Antigen merupakan makromolekul  atau partikel yang terdiri atas protein  atau polisakarida. Secara umum, bobot molekul (BM) senyawa yang  dapat mengimbas terbentuknya antibodi adalah ≥ 5000, walaupun da beberapa molekul yang lebih kecil yang dapat mengimbas terbentuknya antibodi. Keimunogenan antigen tergantung pada sifat fisikokimiawi suatu senyawa, hewan percobaan, dan metode imunisasi yang digunakan.

Kreaktifan antigen (antigenic reactivity) adalah kemampuan antigen untuk membentuk ikatan khas dengan antibodi. Bafian antigen yang mampu mengimbas antibodi dikenal juga dengan istilah epitop atau antigen determinant. Epitop mempunyai struktur tiga dimensi dari asam amino yang kompatibel dengan bagan pengikat dari molekul antibodi. Ada dua tipe epitop, yaitu epitop runutan 5-7 asam amino (comformational determinant). Antibodi yang diimbas oeh epitop struktur polipeptida tidak dapat bereaksi dengan bentuk linier dari polipeptida antigen tersebut.

Epitop pada suatu antigen dapat dipisahkan menggunakan reaksi enzimatis. Walaupun epitop tersebut terlalu kecil untuk mengimbas terbentuknya antibodi, tetapi molekul tersebut terlalu kecil untuk mengimbas terbentukny antibodi,tetai molekul tersebut dapat diikatkan pada suatu molekul pembawa (carier) seperti bovine serum albium. Molekul pembawa yang dapat digunakan untuk memproduksi antibodi dari epitop yang mempunyai bobot molekul rendah dikenal dengan istilah helper.

2.       Antibodi

Antibodi diproduksi oleh hewan sebagai tanggapan terhadap adanya antigen yang masuk ke dalam sistem peredaran darahnya. Antibodi adalah protein kelompok senyawa imunoglobuin yag secara khas dapat diberikan dapat berikatan dengan antigen. Antibodi diprodksi oleh sel plasma yaitu populasi sel merupakan dedferensiasi dari sel limposit-B. Antibodi dalam konsentrasi tertentu terdapat dalam serum darah. Serum darah yang mengandung antibodi dikenal juga dengan istilah antiserum. Selama reaksi pertahanan, antibodi beredar bersama darah dan cairan limpa ke beberapa target untuk mengikat antigen. Molekul antibodi mempunyai satu atau lebih sisi ikat yang dikenal dengan istilah paratop (paratope). Paratop itu akan bereaksi hanya dengan moekul antigen yang mengimbasnya.

Imunoglubulin merupakan protein fungsi yang terbentuk huruf Y. Imunoglubulin terdiri atas struktur dasar, yaitu dua rantairingan L (light chains) dan dua rantai berat H (heavy chains). Rantai asam amino penyusun antibodi diikat oleh ikatan nirkovalen dan disulfida. Imunoglobulin terdiri atas lima tipe rantai H, yat IgG,IgM,ID,dan IgE, tetapi mempunyi rantai ringan yang sama. Bila polipeptida dari molekul imunoglobulin dipisahkan, maka rantai H mempunyai BM 50.000 – 70.000 dalton dan rantai L 20.000 – 25.000  dalton.

Konsentrasi IgD dan IgE dalam serum darah sangat rendah. Kedua tipe itu berperan sangat kecildalam reaksi imun. Sampai saat ini, hanya dua kelas antibodi,yaitu IgG dan IgM yang banyak dipelajari dengan digunakan dalam serologi virus tumbuhan. IgG paling dominan dalam serum darah, yaitu 75% dari seluruh molekul imunoglobulin.

3.      Antibodi poliklon

Antibodi poliklon merupakan suatu populasi yang bereaksi terhadap lebih dari satu epitop. Antiodi poliklon diperoleh dari serum darah hewan yang telah diimunisasi dengan antigen yang mempunyai lebih dari satu epitop. Antibodi pertama kali di produksi oleh hewan apabila diinjeksi antigen adalah IgM atau disebut juga tanggap imun  primer. Konsentrasi IgM mencapai puncak pada 10 hari setelah imunisasi dan setelh itu konsentrasi IgM akan menurun. Setelah konsentrasi IgM menurun ,IgGakan diproduksi dan mencapai puncak pada 14 hari setelah imunisasi. Apabila injeksi dilakukan lagi, maka IgGakan diroduksi lebih dominan sebagai tanggap imun skunder.

Setiap hewan berdarah panas dapat dijadikan sebagai hewan percobaan untuk produksiantibodi poliklon. Kelinci, ayam, burung puyuh,tikus,kambin babi, dan mencit paling banyak digunakan untuk membuat antiserum. Diantara hewan itu, kelinci merupakan hewan murah, mempunyai konsentrasi antibodi yang relatif tinggi, dan memerlukan sedikit antigen imunisasi.

4.      Imunisasi

Imunisasi adalah suatu proses memasukkan antigen ke dalam sistem peredaran darah hewan penghasil antiserum. Konsentrasi antigen yang dibutuhkan untuk imunisasi tergantung pada sifat antigen, hewan percobaan, dan metode injeksi. Periode imunisasi yang lebih panjang dapat menghasilkan konsentrasi antibodi yang lebih tinggi, tetapi akan menghasilkan kekhasan antibodi yang lebih rendah.

Metode imunisasi yang biasa digunakan untuk meningkatkan produksi antibodi adalah kombinasi injeksi pembuuh darah (intravenous) dan otot (intramuscular) dalam periode injeksi 3-4 minggu.injeksi ke dlam pembuluh darah mampu mendistribusi antien secara relatif ebih cepat, tetapi antigen secara lebih cepat, tetapi antigen dapat rusak lebih cepat dalam sisem peredaran darah hewan. Antigen dapat dicampur dengan ajuvan sebelum diinjeksikan untuk meningkatkan konsentrasi antibodi yang ihasilkan.ajuvan berfungsi sebagai pengemulsi antigen dan sebagai depot antigen dalam jaringan hewan. Ajuvan akan melepaskan antibodi secara lambat,sehingga akan mengimbas terbentuknya antibodi lebih banyak.

Pencampuran antara larutan antigen dan ajuvan (freud,s adjuvan) dengan perbandingan 1;1 banyak digunakan untuk injeksi ke dalam otot. Ajuvan mengandung parafin oil, pengemulsi, dan mannide monooleat. Ajuvan lengkap (complete freud,s adjuvans) juga mengandung Mycobacterium tubercolosis yang telah dimatikan dengan perlakuan panas. Ajuvan lengkap lebih efektif untuk mengimbas tanggap imun dibandingkan dengan ajuva tidak lengkap biasa diberikan untuk pertama dengan metode injeki otot dengan seterusnya digunakan ajuvan.

Tidak lengkap. Skema pembuatan antibodi poliklon untuk virus tumbuhan dapat dilihat pada gambar 42.

C. Teknik Serologi Virus Tumbuhan

1.      Teknik Difusi Agar

            Uji serologi menggunakan teknik difusi agar merupakan teknik serologi yang banyak digunakan untuk deteksi dan identifikasi virus tumbuhan. Teknik difusi agar terdiri atas teknik difusi agar tunggal (single diffusion) dan difusi agar ganda (double diffusion). Dalam difusi agar tunggal, antigen yang akan dideteksi berdifusi pada media yang mengandung antibodi. Presipitasi sebagai tanda reaksi positif  reaksi antigen dan antibodi terjadi di sekitar lubang antigen. Sebaiknya, pada teknik difusi agar ganda, antigen dan antibodi berdifusi dalam media agar. Presipitasi pada teknik difusi agar ganda terjadi di antara lubang antigen dan antibodi.

a.       Teknik Difusi Agar Tunggal

1)      Difusi Agar Tunggal Menggunakan Tabung Reaksi

            Pada uji serologi dengan teknik difusi agar tunggal, antigen dalam bentuk cair berdifusi dalam agar yang mengandung antiserum. Agar yang mengandung antiserum dibuat dalam tabung kecil (10 x 15 mm). Presipitasi terjadi apabila antigen bergerak kebawah melalui difusi dalam matrik agar (Gambar 43). Kecepatan difusi antigen tersebut ditentukan oleh koefisien difusi antigen, konsentrasi antigen dan antibodi, serta sifat fisik dan kimia agar. Apabila reaksi itu positif, akan terjadi presipitasi yang merupakan reaksi antara antigen dan antibodi.

2)      Difusi Agar Tunggal Menggunakan Cawan Petri

            Pada uji serologi difusi agar tunggal menggunakan cawan petri, antigen berdifusi dalam agar yang mengandung antiserum (Gambar 44). Apabila antigen dan antibodi sesuai, maka akan terjadi presipitasi berupa bintik putih membentuk cicin disekitar antigen.

Gambar 44. Uji serologi dengan teknik difusi agar tunggal. Presipitasi berbentuk cicin merupakan hasil reaksi antigen dan antibodi; konsentrasi virus (antigen) dalam sampel dapat diamati berdasarkan ketebalan presipitasi (Hamton et al., 1990).

b.      Teknik Difusi Agar Ganda

1)            

Difusi Agar Ganda dalam Tabung Reaksi (Oakley and Fulthorpe Technique)

            Pada difusi agar ganda dengan teknk ini, antigen dan antibodi secara bersamaan berdifusi dalam agar yang tidak mengandung antiserum, seperti halnya pada difusi agar tunggal. Tata letak antigen dan antiserum di dalam tabung reaksi yang dipakai untuk uji serologi dapat dilihat pada Gambar 45.

2)      Difusi Agar Ganda dalam Cawan Petri (Ouchterlony Technique)

            Pada uji serologi difusi agar ganda, antigen danantibodi diletakan pada agar. Pertemuan dan persipitasi antigen-antibodi terjadi pada agar yang terletak di antara lubang antigen dan antibodi. Hasil uji serologi dengan teknik difusi agar ganda dapat dilihat pada Gambar 46.

Gambar 46. Hasil uji serologi dengan teknik difusi agar ganda (Hamton et al., 1990)

(B) Antiserum potato virus Y (PVY).

(1) PVY yang menyerang kentang.

(2) PVY yang menyerang cabai.

(3) TEV yang menyerang tembakau.

(4) TEV yang menyerang cabai.

(5) dan (6) Tanaman sehat.

2.      Enzim-Linked Immunnosorbent Assays (Elisa)

            ELISA (Enzim-Linked Immunnosorbent Assays) telah banyak mengalami modifikasi sejak pertama kali teknik ini deperkenalkan. Ciri utama ELISA adalah digunakannya enzim (alkalin fosfatase atau peroksidase) untuk reaksi imunilogi. ELISA digunakan pertama kali pada tahun 1969 untuk dekteksi virus. Ikatan kovalen antara molekul imunogglobulin dan enzim dapat digunakan untuk mengaplifikasi reaksi antigen-antibodi. Penemuan ini telah membawa dampak yang sangat besar dalam meningkatkan daya deteksi serologi. Pada virus tumbuhan, ELISA pertama kali digunakan pada tahun 1977 (Clark & Adam (1977)). ELISA telah digunakan untuk mendeteksi antigen yang berasal dari tanaman seperti virus tumbuhan, mikoplasma (MLO), bakteri, dan jamur.

            Saat ini, ELISA banyak digunakan untuk mendeteksi patogen tanaman, khususnya pada bahan tanaman yang diproduksi secara vegetatif. Secara umum, prosedur ELISA yang banyak digunakan dalam virologi tumbuhan  adalah (1) ELISA langsung, (2) ELISA tak langsung, dan (3) ELISA penangkap antigen atau ELISA lapis ganda (sandwich).

a.       ELISA Langsung

            ELISA langsung merupakan metode ELISA yang paling sederhana (Gambar 47). Hasil ELISA akan terlihat setelah dimasukan substrat (senyawa) dari enzim yang digunakan sebagai label antibodi. Teknik ini merupakan antibodi yang khas untuk antigen yang didektesi. Kelemahan utama dari teknik ini adalah tidak fleksibel. ELISA langsung adalah apabila enzim yang dipakai untuk amplifikasi reaksi diikatkan secara kovalen pada antibodi yang langsung berikatan dengan antigen. Antigen yang akan dideteksi diikatkan langsung pada permukaan padat.

b. ELISA Tak Langsung

ELISA tak langsung adalah apabila enzim diikatkan  pada antibodi sekunder yang berkaitan dengan antibodi primer (Gambar 48). ELISA tak langsung merupakan metode ELISA yang paling sederhana yang dapat digunakan untuk mengukur konsentrasi antibodi. Antigen dan antibodi sekunder biasanya dibuat konstan dan yang berubah adalah antibodi primer. Pada gambar di bawah ini dapat dilihat perbedaan kedua prosedur ELISA tersebut.

c. ELISA Lapis Ganda( ELISA Sanwich)

ELISA lapis ganda dicirikan oleh antibodi pengangkap antigen yang diikatkan pada fase padat (Gambar 49). Teknik ini dapat diikuti dengan ELISA langsung ataupun ELISA tak langsung.

D. Rangkuman

Pemisahan virion dengan bagian tanaman inang secara in vitro dikenal dengam istilah pemurnian virus. Virus murni diperlukan sebagai antigen dalam produksi antiserum. Oleh sebab itu, prosedur pemurnian virus harus mampu menghasilkan virus murni berupa virion  yang utuh dan tidak dicampuri oleh sisa tanaman inang. Kemurnian virion merupakan faktor penting yang harus diperhatikan untuk memproduksi antibodi virus. Virus yang tidak murni apabila dijadikan antigen akan menghasilkan antibodi yang selain bereaksi dengan virus juga bereaksi dengan bagian tanaman yang tersisa. Sisa tanaman itu dapat juga mengimbas terbentuknya antibodi selain virion. Antigen yang tidak murni akan menghasilkan antibodi yang bereaksi tidak khas terhadap virus yang menjadi sasaran deteksi.

Antigen adalah setiap senyawa yang mampu mengimbas tanggap imun bila di injeksikan ke dalam hewan berdarah panas. Senyawa yang dapat merangsang terbentuknya antibodi biasanya merupakan benda asing yang secara genetika tidak dapat disandikan oleh hewan percobaan. Antigen merupakan makromoekul atau partikel yang terdiri atas protein atau polisakarida. Secara umum, bobot molekul (BM) senyawa yang dapat mengimbas reaksi antibodi adalah  ≥ 5000, walaupun ada beberapa molekul yang lebih kecil yang dapat mengimbas terbentuknya antibodi. Keimunogenan antigen tergantung pada sifat fisikokimiawi suatu senyawa, hewan percobaan, dan metode imunisasi yang digunakan.

Antibodi diproduksi oleh hewan sebagai tanggapan terhadap adanya antigen yang masuk kedalam sistem peredaran darahnya. Antibodi adalah protein kelompok senyawa imunoglobulin yang secara khas dapat berikatan dengan antigen. Antibodi diproduksi oleh sel plasma yaitu opulasi sel yang merupakan deferensiasi dari sel limposit-B. Antibodi dalam konsentrasi tertentu terdapat dalam serum darah dan serum darah yang mengandung antibodi dikenal juga dengan istilah antiserum. Selama reaksi pertahanan, antibodi beredar bersama darah dan cairan limpa ke beberapa target untuk mengikat antigen. Molekul antibodi mempunyai satu atau lebih sisi ikat yang dikenal dengan istilah paratop. Paratop itu akan bereaksi hanya dengan molekul antigen yang mengimbasnya.

Uji serologi menggunakan teknik difusi agar merupakan teknik serologi yang banyak digunakan untuk deteksi dan identifikasi virus tumbuhan. Teknik difusi agar terdiri atas teknik difusi agar tunggal dan difusi agar ganda (double diffusion). Difusi agar tunggal adalah apabila antigen yang akan dideteksi berdifusi pada media yang mengandung antibodi. Presipitasi sebagai tanda reaksi positif reaksi antigen dan antibodi terjadi disekitar lubang antigen. Sebaliknya,

pada teknik difusi agar ganda, antigen dan antibodi berdifusi dalam media agar. Presipitasi pada teknik difusi agar ganda terjadi di antara lubang antigen dan antibodi.

ELISA telah banyak mengalami modifikasi sejak pertama kali teknik ini di perkenalkan. Ciri utama ELISA adalah digunakannya enzim (alkalin fosfatase atau peroksidase) untuk reaksi imunologi. Teknologi deteksi virus merupakan pengetahuan yang diperlukan dalam kajian epidemiologi penyakt virus.

ELISA digunakan pertama kali pada tahun 1969 untuk deteksi virus. Ikatan kovalen antara molekul imunoglobulin dan enzim dapat digunakan untuk mengamplifikasi reaksi antigen-antibodi. Peneman ini telah membawa dampak yang sangat besar dalam meningkatkan daya deteksi serologi. ELISA telah digunakan untuk deteksi antigen yang berasal dari tanaman sperti virus tumbuhan, mikoplasma (MLO), bakteri, dan jamur. Saat ini, ELISA banyak digunakan untuk deteksi patogen tanaman khususnya pada bahan tanaman yang diproduksi secara vegetatif. Secara umum, prosedur ELISA yang banyak digunakan dalam virologi tumbuhan adalah (1) ELISA langsung, (2) ELISA tak langsung, dan (3) ELISA penangkap antigen atau ELISA lapis ganda.

E. DAFTAR PUSTAKA

Akin, H.M., S. Susanto, and YB, Sumardiyono, 1995. Pemurnian Garlic

Mosaic Virus. BPPS-UGM 8 (3B) : 325-335.

Akin, M.H., Susamto, and Sumardiyono. 1993. “Penggunaan SDS

polyacrilamede gel elektroforesis untuk menoptimasi prosedur

pemurnian garlic mosac virus.” Dalam: Simposium dan Seminar Nasional PFI, Yogyakarta 6-9 September 1993.

Hamton, H., E. Ball, S.De Boer. 1990. Serological Methods for Detection and Identification of Viral and Bacterial Plant Pathogen. APS Press. Minnesota, 389 p.

Matthews, R.E.F. 1991.Plant Virologi. 3rd Ed. Academic Press. New York.

Matthews, R.E.F. 1992. Fundamental of Plant Virology. 3rd Ed. Academic Press. New York.

Van Regemortel, M.H.V.1982. Serology and immunochemistry of plant viruses. Academic Press. New York.

F. Pelatihan

1. Prinsip dasar yang harus diperhatikan dalam pemurnian virus tumbuhan adalah (1) ..., (2) ..., (3) ..., (4)

2. Tanaman perbanyakan virus lebih baik apabila tanaman itu mengandung senyawa (1) ..., (2) ..., dan (3) ... dalam kadar rendah, karena senyawa tersebut dapat merusak dan mengaktifkan virion dalam proses pemurnian.

3. Pemisahan dan pengendapan virus dapat dilakukan dengan beberapa cara yaitu (1) ..., (2) ..., dan (3) ...

4. Secara umum, reaksi serologi dapat digambarkan sebagai berikut: (1) ...+ (2)....→ Presipitasi

5. Senyawa yang mampu mengimbas tanggap imun bila diinjeksikan kedalam hewan berdarah panas disebut (1) ..., sedangkan molekul protein kelompok imunoglobulin yang diproduksi hewan percobaan dan bereaksi khas terhadap senyawa itu disebut (2) ...

6. Jelaskan apa yang dimaksud dengan (1) epitop, (2) paratop, (3) antibodi poliklon!

7. Teknik uji serologi yang banyak digunakan dalam virologi tumbuhan meliputi teknik serologi yang konvensional seperti (1) ... dan teknik serologi yang mutakhir seperti (2)...

8. Teknik difusi agar terdiri atas (1) ..., (2) ...

9. Secara umum, ELISA yang banyak digunakan dalam virologi tumbuhan adalah (1) ..., (2) ..., dan (3) ...